PENGARUH EKSTRAK TANAMAN BAGI POPULASI MIKROBA, EMISI METHAN DAN KARAKTERISTIK FERMENTASI RUMEN SECARA IN VITRO

PENGARUH EKSTRAK TANAMAN BAGI POPULASI MIKROBA, EMISI METHAN DAN KARAKTERISTIK FERMENTASI RUMEN SECARA IN VITRO

Diterjemahkan oleh : Afduha Nurus Syamsi

Magister Ilmu Peternakan, UNSOED 2014

PENDAHULUAN

Global warming merupakan efek dari peningkatan temperatur atmosfir bumi, hal tersebut menyebabkan terjadinya perubahan iklim yang mengarah pada eksaseberasi peristiwa cuaca yang ekstrim dan frekuensi munculnya kejadian tersebut pada beberapa daerah. Peningkatan gas rumah kaca di atmosfer khususnya methantelah menjadi fokus pada berbagai penelitian tentang pemanasan global (IPPC), kontribusi methan dalam mempengaruhi pemanasan global adalah 23 kali lebih kuat dibandingkan CO2. Diperkirakan bahwa pada bidang peternakan menghasilkan 18% dari total emisi gas rumah kaca yang menyebabkan peningkatan global warming, dan merupakan salah satu yang terbesar dibandingkan gas lain. Melalui sitem pencernaan ruminansia yang unik dapat menghasilkan methan selama proses fermentasi terjadi dan terakumulir sekitar 15% dari total emisi methan (Takahashi, 2005). Selain itu, emisi methan merupakan hilangnya sumber karbon dari rumen, yang menyebabkan penggunaan energi pakan yang tidak produktif dan menyebabkan kerugian besar hingga 12% energi dari pakan yang dikonsumsi (jhonson, 1995). Berbagai pendekatan, seperti seleksi mikroorganisme rumen melalui pengurangan populasi protozoa, inokulasi strain bakteri exogenus dan vaksinasi terhadap mikroorganisme metanogen, telah dipelajari untuk mengurangi emisi gas methan dari pencernaan ruminansia. Ekstrak tanaman sebagai pakan aditif baru merupakan trobosan baru yang aman dan murah untuk mengatasi/mengurangi emisi gas methan pada pencernaan ruminansia. Banyak jenis ektrak tanaman seperti tanin dan saponin yang digunakan untuk mengurangi emisi gas metahn dalam pencernaan ruminansia (Patra, 2010). Dalam peneltian laboratorium sebelumnya, tanaman dan bahan aditif berbeda yang diekstrasi dengan berbagai pelarut (metanol, etanol dan air mendidih) serta efeknya terhadap emisi gas methan serta kegiatan fermentasi rumen telah dilakukan. Patra (2010) menyatakan bahwa fermentasi rumen yang dilaksanakan secara invitro mungkin akan terpengaruh oleh dosis tertentu dari ekstrak dan pelarut ekstrak yang digunakan. Tanaman yang termasuk dalam keluarga/family Compositate dan Liliaceae memiliki pengaruh besar dalam mengurangi emisi gas methan pada studi yang sebelumnya pernah dilaksanakan.

            Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkaji efek beberapa ekstrak tanaman dengan sifat antioksidan sebagai sumber aktivitas antimikroba untuk memanipulasi famili serta ekosistem mikroba rumen. Serta untuk mengevaluasi efek dari ekstrak bebeapa tanaman pada emisi gas methan serta fermentasi rumen secara in vitro.

METODE DAN MATERI

Inkubasi Invitro

Ternak : Sapi berfistula rumen jenis Holstein dengan bobot 500 kg digunakan sebagai dono cairan rumen. Timothy dan konsentrat komersial (TDN 73,5%, PK 19%, LK 3%, SK 12%, abu 10%, ca  0,8%, P 1,2%, aminotek dan CJ feed) dengan perbandingan 3:2 diberikan sebesar 2% dari bb sapi sebanyak 2 kali sehari.

Cairan rumen : Cairan rumen diambil dari fistula sebelum makan pagi. Sampel cairan dimasukan botol hangat dengan CO2, kemudian disaring dengan 4 lapisan kain tipis dan sebelum dicampur dengan larutan penyangga (Mcdouglas) suhu dipertahankan pada 39⁰C dan dengan gas N2O2.

Ekstrak tanaman : Ektrak tanaman didapakan dari PEB (Plant Extract Bank di Korea Research Institute of Bioscience and Technologi. Tanaman dikumpulkan dari berbagai perkebunan di Korea (Tabel 1). Setiap tanaman di potong-potong kecil dan dikeringkan secara alamai di bawah sinar matahari. Tanaman diekstrasi dengan menggunakan methanol (MeOH) dan disimpan pada suhu -20⁰C sampai digunakan. Stok larutan (20mg/ml) ekstrak disiapkan dalam DMSO (dimetil sulfoksida)

Inkubasi Invitro : Cairan rumen  disaring dengan 4 lembar kain tipis sebelum dicampurkan dengan McDouglas dan suhu dipertahan kan pada 39⁰C. Cairan rumen dan McDouglas dicampur sebanyak 30 ml dengan perbandingan 4:1. Campuran cairan di masukan dalam botol serum dalam kondisi an aeron dan diberi gas N2O2 yang juga mengandung 0,3 gr Substrat Tomothy dan ekstrak tumbuhan (1% dari total volume) ditutup dengan karet. Botol-botol serum di inkubasi dalam shaker water bath (HBS-201 Sl, Hanbaek, Korea) pada suhu 39⁰C selama 24 jam.

Analisis

Produksi gas total diukur dengan metode Assay dari Theodorou (1994). Sebuah detektor tranduser tekanan dan detektor voltmeter digital digunakan untuk mengukur tekanan gas melalui karakteristik fermentasi yang terjadi. Pada pengukuran produksi gas total, transduser dimodifikasi sedemikian rupa agar dapat dihubungkan dengan inlet dari Luer-lock three-way stapcock (Theodorou, 1994). Tekanan gas pada headspace dibaca dari unit display setelah insersi jarum suntik melewati karet butil stoper atas efek dari media kultur. Gas pada bagian headspace pada botol serum di kumpulkan untuk dianalisis komposisi gasnya, terutama methan dan karbondioksida. Methan dan karbondioksida dianalisa dengan kromatografi gas yang dilengkapi dengan kolom. Inokulum yang diinkubasi akan disampling untuk analisis pH, VFA, konsentrasi dan ekstrasi DNA  secara keseluruhan. Analisis VFA dilakukan dengan kromatografi gas (Erwin, 1961).

Ekstraksi DNA, PCR Primer dan Real-Time PCR

Ekstrasi DNA : Tissuelyser, sebuah penggoyang bolak-balik berkecepatan tinggi yang mempertahankan sampel dalam tabung screw-capped dengan kandungan butiran silika digunakan untuk ekstrasi DNA. Jumlah asam nukleat telah diekstrasi dari sampel rumen yang diinkubasi menggunakan modifikasi bead-beating protocol dengan QIAamp DNA mini kit . untuk sampel, 1 ml cairan dari 30 ml campuran cairan yang diinkubasi menggunakan pipet wide bore sehingga dapat meyakinkan bahwa sampel mengandung cairan dan digesta secara homogen.  Konsentrasi asam nukleat diukur dengan menggunakan spektofotometer NanoDrop.

PCR Primer : Rangkaian PCR primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah untuk ampifikasi bakteri secara umum, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, Archaea metanogen dan Ciliata metanogen juga golongan bakteri selulolitik yang dilakukan dengan mesin rotor gene-real-time PCR yang menggunakan IQ SYBR supermix hijau. Siklus threshold diamati setelah real-time PCR yang digunakan untuk mengamati kelipatan dari perubahan (jumlah) populasi mikroba berbeda yang relatif antara perlakuan kontrol tanpa ekstrak tanaman dan perlakuan dengan ekstrak tanaman. Jumlah mikroba dapat dihitung dengan rumus kuantitas relatif : = 2^{-∆CT (Target)- ∆CT(Control)}, dimana Ct adalah siklus threshold. Semua kuantitas (q) gabungan reaksi PCR (volume final sebesar 25µl) mengandung primer maju dan mundur,  IQ SYBR supermix hijau dan DNA temlpate mulai dari 10 ng sampai 100 ng. Sebuah kontrol negatif tanpa DNA temlate digunakan dalam setiap qPCR assay untuk setiap primernya. Amplifikasi PCR dari target DNA, termasuk annealing dan ekstensi temperatur, dilaksanakan mengikuti tabel 2.

Analisis Statistik

Data dianalisis dengan menggunakan prosedur GLM (General Linier Model) dari sistem analisis statistik institue. Perbedaan antara perlakuan atau signifikansi antar perlakuan akan diuji lanjut dengan Duncan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik Fermentasi Rumen

Produksi gas total invitro, emisis methan dan produksi karbondioksida dapat dilihat pada tabel 3. Produksi gas total pada seluruh perlakuan ekstrak tumbuhan adalah sangat signifikan (p<0.05) lebih tinggi dibandingkan kontrol, dan produksi gas total dari ekstrak ginger adalah tertinggi (p<0.05). Emisi methan yang tertinggi (p<0.05) adalah pada sampel kontrol dan terendah adalah pada sampel ekstrak garlic dengan pengurangan emisis methan hingga 20%. Ekstrak tanaman lain juga menurunkan emisi gas methan. Sama seperti Garca (2008) yang melaporkan bahwa Alium sativum dapat menurunkan hingga 20% konsentrasi methan dan total produksi methan. Kamra (2008) juga menemukan bahwa ekstrak Alium sativum  menurunkan produksi methan hingga lebih dari 25%. Produksi karbon dioksida pada ekstrak ginger adalah tertinggi, sedangkan untuk ekstrak Alium sativum adalah terendah. Total konsentrasi VFA dan pH tidak dipengaruhi oleh penambahan ekstrak tumbuhan (non signifikan). Namun, total konsentrasi VFA pada penambahan ekstrak jeruk mandarin adalah tertinggi, sedangkan ekstrak bawang adalah terendah. Rasio asetat dan propionat pada penambahan ekstrak garlik dan ginger secara signifikan lebih rendah  dari kontrol. Emisi gas methan di dalam rumen berkaitan erat denga A:P rasio, dan penurunan emisi gas methan menyebabkan proporsi molar tinggi dan rendah rasio A:P. Pembentukan propionat dari suksinat akan menyebabkan rendahnya ketersedian H2 untuk proses metanogenesis. Hal tersebut menunjukkan bahwa sifat antimikroba dari ekstrak tanaman mempengaruhi proses metanogenesis yang menyebabkan pengurangan emisis gas methan.

Populasi Mikroba Rumen

Tekhnik molekuler culture-independent digunakan sebagai alat untuk mendapatkan informasi mengenai kumpulan mikroba tanpa kultivasi. Assay molekuler, hibridisasi DNA, real-time PCR, denaturasi komposisi elektroforesis gel dan tekhnik lainya digunakan untuk mempelajari perubahan kuanttatif mikroba perubahan philogenetik dari kelompok mikroba di dalam lingkungan rumen. Populasi Ciliata terika methan dipengaruhi oleh semua ekstrak tumbuh-tumbuhan seperti pada gambar 1 dan menurun lebih dari kontrol. Temuan tersebut sesuai dengan beberapa penelitian dimana populasi ciliata terikat methan mengalami penurunan dengan penambahan Alium sativum, ginger, jerung mandarin dan ekstrak honeysuckle. Pada penelitian ini diketahui bahwa penambahkan ekstrak Alium sativum dan ginger dapat mengurangi populasi protozoa dan mengurangi emisi gas methan di dalam rumen. Dan menghambat metanogenesis. Zhang (2011) melaporkan bahwa penambahan jahe bubuk mempengaruhi fermentasi mikroba rumen pada percobaan in vivo. Pengaruh ekstrak tumbuh-tumbuhan pada populasi mikroorganisme fibrolitik utama, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, dan Ruminococcus flavefaciens masing-masing dapat dilihat pada gambar 2, 3 dan 4. Populasi  Fibrobacter succinogenes pada penambahan selruh jenis ekstrak tanaman terbukti memiliki kecenderungan meningkat. Komunitas /populasi Fibrobacter succinogenes dengan penambahan ekstrak wromwood, garlic, jeruk mandarin, dan honeysuckle meningkat lebih tinggi dibandingkan yang lain.  Keragaman Ruminococcus albus yang ditambah garlic meningkat, sedangkan ekstrak tumbuhan lainya tidak mempengaruhi (gambar 3) dan populasi Ruminococcus flavefaciens menurun dengan penambahan ekstrak wormwood dan ekstrak garlic, tetapi dibandingkan kontrol meningkat dengan penambahan ekstrak lainya juga (gambar 4). Fiamegos (2011) melaporkan bahwa ekstrak wormwood  memiliki aktivitas antimikrobila yang kuat, terutama pada bakteri gram positif yang patogen. Garlic dan Alium cepa memiliki spektrum yang luas dari aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram-negatif dan gram positif seperti Bacillus subtilis, Salmonella, dan E. Coli , yang berhubungan dengan persentase kandungan senyawa terpenoid dan phenolic. Muetzel (2003) melaporkan bahwa perkembangan Fibrobacter succinogenes dan Ruminococcus flavefaciens tidak dipengaruhi oleh penambahan daun Sesbania pachycarpa yang mengandung saponin untuk menhambat Ruminococcus albus secara invitro. Honeysuckle yang mengandung senyawa beracun seperti saponin, alkaloid dan tanin yang menunjukkan hasil/pengaruh yang sama terhadap bakteri.

Kesimpulan dari penelitian ini bahwa ekstrak tanaman terbukti dapat mengurangi methanogenesis dan berpotensi untuk digunakan sebagai bahan aditif pada pakan ruminansia tanpa menggangu fermentasi rumen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak tanaman yang digunakan dalam percobaan dapat menjadi pakan aditif yang menjanjikan untuk mengurangi emisi gas methan dan meningkatkan fermentasi rumen.

PROBIOTIK

PROBIOTIK

Oleh : Afduha Nurus Syamsi (D1E010034)

Mahasiswa Magister Ilmu Peternakan Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto

2014

            Probiotik dapat definisikan sebagai bakteri non patogen yang secara normal terdapat dalam saluran cerna manusia dan merupakan bakteri yang memberikan proteksi usus terhadap bakteri patogen. Menurut Meurman (2007), berdasarkan keputusan FAO/WHO Expert Consultation tahun 2001, probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup, yang memberikan manfaat kesehatan pada host ketika diberikan dalam jumlah yang memadai. Umumnya jenis mikroba yang digunakan sebagai probiotik adalah pada golongan Lactobacillus dan Bifidobacterium. Widyastuti (2011) menambahkan bahwa probiotik dikonsumsi sebagai pangan fermentasi dengan menambahkanya pada prosuk pangan tertentu (pangan probiotik). Pangan Probiotik adalah makanan atau minuman yang mengandung mikroorganisme-mikroorganisme yang diharapkan masuk ke dalam tubuh dan dapat berguna untuk meningkatkan kesehatan  tubuh. Makanan probiotik dapat berbentuk yogurt, keju, mentega, susu formula yang difortifikasi dengan bakteri asam laktat atau bentuk pangan lainya.

            Sesuai dengan definisinya, probiotik merupakan suplemen yang berisi mikroba hidup (Salminen, et.al., 1998). Probiotik dapat berupa bakteri, jamur, dan atau ragi, tetapi kebanyakan  probiotik adalah bakteri dan bakteri asam laktat adalah yang paling populer dalam daftar spesies organisme yang digunakan dalam preparasi probiotik. Bakteri asam laktat tersebut meliputi Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophillus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, spesies Bifidobacterium dan Escherichia coli. Mulder et.al. (1997) dalam kesempatan lain menyatakan bahwa mikroba yang telah direkomendasikan oleh beberapa peneliti sebagai sumber probiotik diantaranya adalah Bacillus subtilis, Bacillus lecheniformis, Bacillus toyoi, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus, Streptococcus dan Yeast. Menurut Singh et.al. (2011), spesies bakteri tersebut mampu menahan kondisi asam dan garam empedu pada saluran gastro-intestinal manusia. Bakteri probiotik juga menghasilkan unsur bacteriosin yaitu zat yang mampu membunuh mikroorganisme berbahaya. Tamime (2002) mengungkapkan bahwa para peneliti di berbagai negara telah mengidentifikasi banyak mikroorganisme probiotik dan beberapa contoh jenis bakteri probiotik dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Jenis Bakteri Probiotik

                                      

Cara kerja probiotik adalah dengan membantu menurunkan derajat keasaman dan menghambat pertumbuhan organisme penganggu dalam sistem pencernaan. Klaim (2006) mengungkapkan bahwa probiotik juga ikut berperan dalam meningkatkan kekebalan tubuh melalui stimulasi sel-sel tertentu di usus. Fuller (2002) juga menyatakan bahwa keseimbangan mikroba usus tercapai apabila mikroorganisme yang menguntungkan dapat menekan mikroorganisme yang merugikan. Prinsip kerja probiotik meliputi kompetisi untuk mendapatkan zat makanan, kompetisi mendapatkan tempat adhesi pada dinding usus, dan penghambatan secara langsung terhadap kehidupan mikroba yang dikalahkan. Probiotik harus mampu mengerahkan efek yang menguntungkan pada hewan inang, misalnya meningkat pertumbuhan atau ketahanan terhadap penyakit. Probiotik harus bersifat non pathogenik, tidak beracun, stabil di bawah kondisi penyimpanan, mampu bertahan dan melakukan metabolisme dalam lingkungan usus misalnya ketahanan terhadap pH rendah, asam organik dan asam empedu. Prinsip dari penggunaan probiotik yaitu harus mampu bertahan dalam saluran cerna manusia, secara ilmiah menunjukkan efek fisiologis yang menguntungkan serta membuktikan sifat yang efektif dan aman untuk digunakan oleh manusia.

Menurut Oelschlaeger (2010), efek probiotik dapat diklasifikasikan menjadi tiga model aksi kerja. Pertama, probiotik mungkin mampu memodulasi pertahanan tubuh host atau sistem imun. Aksi tersebut merupakan hal yang penting dalam pencegahan dan terapi penyakit infeksi, selain itu juga untuk pemeliharaan saluran pencernaan. Model kedua, probiotik juga dapat berefek langsung bagi mikroorganisme lain, baik sesamanya ataupun yang bersifat pathogenik. Prinsip ini pada banyak kasus menjadi sangat penting untuk pencegahan dan pemeliharaan usus dari infeksi dan pemulihan keseimbangan mikroba dalam usus. Model terakhir adalah probiotik mungkin dapat mengamankan produk mikroba seperti racun dan aksi lainya adalah dengan menginaktivkan racun serta melakukan detoksifikasi dari usus.

            Probiotik memiliki kemampuan berkombinasi dengan enzim untuk mendegradasi substansi makanan ke dalam bentuk yang lebih sederhana dan meningkatkan kecernaan. Bakteri probiotik seperti kelompok bakteri asam laktat (BAL) menekan pertumbuhan bakteri patogen dalam saluran pencernaan dengan memproduksi senyawa anti mikroba bagi bakteri patogen (Singh et.al., 2011). Senyawa tersebut merupakan hasil metabolisme dari bakteri probiotik tersebut misalnya; asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, reuterin, dan senyawa penghambat pertumbuhan bakteri patogen lainnya (Widyastuti, 2011). Asam lemak rantai pendek seperti asam laktat, asam propionat dan asam butirat yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat membantu mempertahankan pH dan memproteksi perubahan patologis yang terjadi pada mukosa usus (Singh et.al., 2011). Probiotik memiliki substansi antimikrobial berupa bakteriosin yang mampu menjadi inhibitor bagi replikasi pathogen melalui low molekuler weight dan yang kedua adalah asam empedu terkonjugasi yang memiliki aktivitas antimikrobial yang tinggi sehingga mikroba patogenik dapat terseleksi (Oeschlaeger, 2010). Selain itu, bakteri Probiotik juga dapat menekan pertumbuhan mikroba patogen melalui kompetisi dengan bakteri patogen dalam penyerapan nutrisi dan penempelan pada sel epitel usus sehingga mencegah kolonisasi bakteri patogen penyebab diare akut dan penyakit lain karena mukosa usus telah dipenuhi bakteri probiotik sehingga tidak ada tempat atau reseptor yang dapat digunakan oleh mikroba patogen (Widyastuti, 2011).

             Probiotik mampu mempengaruhi sistem imun melalui produk metabolit, komponen dinding sel dan DNA (Oeschlaeger, 2010). Bakteri probiotik memicu respon imun mukosa yang akan memproduksi sIgA yang sangat berperan dalam imunitas humoral lokal mukosa usus (Local humoral mucosal immunity) dan imunitas yang dimediasi mukosa sel (Mucosal cell mediated immunity). Fenomena ini  memiliki efek menguntungkan untuk menjaga agar sistem imun lokal dalam saluran cerna tetap bereaksi, sehingga dapat mencegah penyakit pada saluran cerna (Widyastuti, 2011). Probiotik mampu meningkatkan respon imun spesifik dan non spesifik melalui aktivasi macrophage yang kemudian akan meningkatkan cytokines, meningkatkan aktivitas sel-sel mati dan meningkatkan level imunoglobulin (Sunders, 1999).    

Probiotik memiliki banyak efek baik bagi kesehatan orang yang mengkonsumsinya. Beberapa strain Lactobacillus bulgaricus menunjukkan efek anti mutagenik karena berikatan dengan senyawa amina heterosiklik. Senyawa tersebut merupakan zat karsinogenik sehingga dapat mencegah terjadinya kanker. Probiotik juga memiliki kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol karena bakteri asam laktat dapat memproduksi enzim bile salt hydrolase yang mampu melakukan metabolisme kolesterol substrat makanan di usus halus. Dekonjugasi garam empedu akan meningkatkan asam empedu terkonjugasi yang tidak mudah diserap dari usus halus. Asam empedu dekonjugasi akan terbuang lewat tinja, sehingga jumlah asam empedu yang kembali kehati berkurang. Penyeimbangkan jumlah asam empedu, tubuh akan mengambil kolesterol di dalam tubuh sebagai prekursor pembentukanya, sehingga jumlah kolesterol dapat berkurang (Widyastuti, 2011). Singh et.al. (2011) menambahkan bahwa probiotik memiliki aktivitas anti kanker, anti hypertensi, mengatasi lactose intolerance dan peningkatan abrsorbsi kalsium di usus. Aktivitas anti hypertensi ditunjukkan oleh dua kativitas tripeptida yaitu valin-prolin-prolin dan isoleucin-prolin-prolin. Tripeptida tersebut berfungsi sebagai inhibitor enzim angiotensin-I-coverting dan menurunkan tekanan darah. Fungsi probiotik bagi penanganan lactose intolerance ditunjukkan dengan menyediakan bakteri laktase yang mampu menghasilkan enzim laktase dan kemudian mampu menghidrolisis laktosa. Selain itu (Widyastuti, 2011), enzim beta-galaktosidase dihasilkan oleh bakteri probiotik yang fungsinya untuk memecah laktosa dalam susu. Proses fermentasi oleh bakteri penghasil asam laktat (BAL) juga akan mengurai laktosa 30% – 40% menjadi glukosa dan galaktosa. Patil dan Reddy (2006) menambahkan bahwa peningkatan kalsium di dalam usus terjadi karena aktivitas bakteri probiotik menyebabkan kondisi yang asam pada usus, sedangkan kalsium terserap baik dalam kondisi asam.

 

 DAFTAR PUSTAKA

Meurman J.H. dan Stamatova .I. 2007. “Probiotics-contributions to oral health”. Oral Dis. 13: 443-451.

Oeschlaeger, T.A. 2010. “Mechanism of Probiotic Action-A Review”. International Jurnal Of Medhical Microbiologi. 300: 57-62. 

Patil MB, Reddy N.2006. “Bacteriotherapy and probiotics in dentistry”. KSDJ . 2: 98-102.

Salminen S & von Wright A. 1998. Lactic Acid Bacteria, 2nd edn. Marcel Dekker.New York.

Singh, K, B. Kalalli, A. Kumar, dan V. Thaker. 2011. “Probiotics: A review”. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. S287-S290

Sanders, M.E. 1999. “Probiotics”. Food Technol.53(11): 67-77.

Tamime, A.Y. 2002. “Fermented milks: a historical food with modern applications—a review”. European Journal of Clinical Nutrition. 56, Suppl 4, S2–S15.

Widyaastuti, E. 2011. Teknologi Pengolahan Hewani Probiotik & Prebiotik. Ilmu dan Teknologi pangan. Univesritas Brawijaya.